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熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct值過晚,該如何解決?

更新時間:2025-07-08點擊次數(shù):21

在熒光定量 PCR 實驗里,無 Ct 值出現(xiàn)和 Ct 值過晚是常讓科研人員頭疼的問題。這些問題會嚴重干擾實驗結(jié)果的準確性與可靠性,接下來我們就深入探討下背后的原因和解決辦法。

熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct值過晚,該如何解決?

一、無 Ct 值出現(xiàn)的原因及解決辦法

(一)循環(huán)數(shù)設(shè)置不合理  正常情況下,PCR 循環(huán)數(shù)一般不宜超過 45 循環(huán)。要是循環(huán)數(shù)設(shè)置不夠,可能因擴增產(chǎn)物量不夠,熒光信號沒達到可檢測水平,導致無 Ct 值。比如在一些低拷貝數(shù)模板的檢測中,若循環(huán)數(shù)只設(shè) 30 次,很可能就檢測不到產(chǎn)物。

解決辦法依據(jù)實驗經(jīng)驗和模板預估量,合理增加循環(huán)數(shù),不過要注意,循環(huán)數(shù)過高也會使背景值提高,定量不準,通常調(diào)整到 35 - 40 循環(huán)較為合適。

(二)PCR 程序里檢測熒光信號步驟有誤  不同熒光定量方法,采集熒光信號的時機有別。像 SG 法一般在 72℃延伸時采集,TaqMan 法則多在退火結(jié)束或延伸時采集。要是 PCR 程序設(shè)置時,熒光采集步驟和所用方法不匹配,或者壓根沒勾選熒光采集選項,那肯定檢測不到熒光信號,也就沒有 Ct 值。

解決辦法:仔細核對所用熒光定量方法的說明書,嚴格按要求設(shè)置 PCR 程序里熒光信號檢測步驟,確保準確采集熒光信號。

熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct值過晚,該如何解決?

(三)引物或探針降解  引物或探針降解后,無法正常和模板結(jié)合并引導擴增,自然不會有擴增產(chǎn)物,也就無 Ct 值??赏ㄟ^ PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解,降解的引物或探針在電泳圖上會呈現(xiàn)出條帶模糊、拖尾等異常。

解決辦法重新合成高質(zhì)量引物和探針,注意引物和探針的保存條件,避免反復凍融,最好小量分裝,存放在 - 20℃或 - 80℃。

 

(四)模板降解或上樣量不夠  模板降解,完整性被破壞,擴增難以進行;上樣量不夠,起始模板拷貝數(shù)少,擴增產(chǎn)物量也會很少,導致熒光信號弱,檢測不到 Ct 值。一般模板上樣量不超 500ng,對未知濃度樣本,應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度開始實驗。另外,樣本準備過程中引入雜質(zhì)、反復凍融,都可能造成模板降解。

解決辦法優(yōu)化樣本提取和保存方法,確保模板質(zhì)量。提取后盡快實驗,如需保存,將模板樣本小量分裝儲備,避免反復凍融。實驗前,用核酸定量儀精確測定模板濃度,依據(jù)濃度調(diào)整上樣量。

 

(五)引物探針設(shè)計不合理  引物設(shè)計要是不合理,像上下游引物 Tm 值差異超 4℃,會影響擴增效率,甚至導致擴增失敗,沒有 Ct 值;引物若不能跨越內(nèi)含子,擴增基因組 DNA 時,可能受內(nèi)含子干擾,影響結(jié)果。

解決辦法借助專業(yè)引物設(shè)計軟件,如 Primer Premier 5.0 等,精心設(shè)計引物。設(shè)計好后,進行 BLAST 比對,確保引物特異性,避免與其他基因序列有過多同源性。

 

二、Ct 值過晚的原因及解決辦法

(一)擴增效率低


  1. 引物間或引物與探針比例不當:引物和探針濃度不合適,比如引物濃度過高,可能形成引物二聚體,競爭模板結(jié)合位點,降低擴增效率;引物和探針比例失衡,也會影響擴增。

解決辦法通過預實驗,優(yōu)化引物和探針濃度及比例,摸索出最佳反應(yīng)體系。

  1. 引物或探針設(shè)計不合理:引物長度、GC 含量、特異性等不合適,都可能致使擴增效率低,Ct 值過晚。比如引物長度過長,退火時難以和模板配對,影響擴增。

解決辦法重新設(shè)計引物和探針,保證引物長度適中(一般 18 - 25bp),GC 含量在 40% - 60%,同時具備高特異性。

(二)PCR 程序不合適

  1. 改用三步法反應(yīng):兩步法反應(yīng)中,退火和延伸在同一溫度進行,可能對某些模板和引物組合效果欠佳。三步法將退火、延伸分開,能更好優(yōu)化反應(yīng)條件。

解決辦法嘗試將 PCR 程序改為三步法,即變性、退火、延伸分別在不同溫度下進行,依據(jù)引物 Tm 值,合理設(shè)置退火溫度。

  1. 優(yōu)化退火 / 延伸溫度:退火溫度過高,引物和模板結(jié)合不充分;過低,易產(chǎn)生非特異性擴增。延伸溫度不合適,會影響 Taq 酶活性和擴增效率。

解決辦法以引物 Tm 值為參考,適當降低退火溫度(一般降低 3 - 5℃),優(yōu)化延伸溫度(通常 72℃左右),通過預實驗確定最佳溫度。

  1. 延長退火 / 延伸時間:退火或延伸時間過短,引物和模板結(jié)合不充分,擴增產(chǎn)物合成,導致 Ct 值過晚。

解決辦法在推薦時間基礎(chǔ)上,適當延長退火 / 延伸時間 10s 左右,觀察擴增效果。

(三)MgCl?濃度不合適Mg²?是 Taq 酶活性必需離子,濃度過高或過低,都會影響 Taq 酶活性和擴增效率。濃度過高,可能增加非特異性擴增;過低,Taq 酶活性受抑制。

解決辦法依據(jù)所用 PCR 試劑盒推薦,適當調(diào)整 MgCl?濃度,通過預實驗確定最適濃度。

(四)PCR 產(chǎn)物過長  PCR 產(chǎn)物設(shè)計超過 500bp,擴增難度會增加,所需時間更長,導致 Ct 值過晚。因為長片段擴增對反應(yīng)條件要求更嚴苛,容易出現(xiàn)擴增效率低的問題。

解決辦法重新設(shè)計引物,縮短 PCR 產(chǎn)物長度,一般控制在 100 - 300bp,更利于高效擴增。

熒光定量 PCR 中無 Ct 值或 Ct值過晚,該如何解決?

(五)模板中存在抑制物     模板提取過程中,若混入蛋白質(zhì)、多糖、有機溶劑等雜質(zhì),這些物質(zhì)可能抑制 Taq 酶活性,降低擴增效率,使 Ct 值過晚。解決辦法使用高純度模板進行 PCR 檢測,或?qū)δ0暹M行稀釋,降低抑制物濃度。也可采用模板純化試劑盒,進一步去除雜質(zhì)。      更多關(guān)于熒光定量 PCR 儀原理、熒光定量 PCR 儀品牌、熒光定量 PCR 儀價格、實時熒光定量 PCR 技術(shù)、熒光定量 PCR 實驗步驟等實驗室儀器,實驗耗材,生物試劑相關(guān)問題,歡迎進入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司網(wǎng)站進行了解。

 

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